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定量PCR(Realtime PCR)技术服务
Realtime-PCR 技术简介

       定量PCR已经从基于凝胶的低通量分析发展到高通量的荧光分析技术,即实时定量PCR。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

实时荧光定量PCR 技术的应用

1、DNA 或RNA 的绝对定量分析:包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测,RNAi 基因失活率的检测等
2、基因表达差异分析:例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 ),特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。
3、基因分型:例如SNP 检测,甲基化检测等。

实验平台及实验方法

        GENELIFE 技术服务平台目前使用的仪器为美国Applied Biosystems公司最新推出的ABI7900HT型高通量实时荧光定量PCR系统。由于其在定量PCR系统领域的领先地位,优越的配置,精准的实验数据,加上快速高通量的强大功能,使得该系统已经成为各大医院,科研机构的首选。
       提供的Realtime-PCR实验服务包括 TaqMan荧光探针法和SYBR Green荧光染料法。

SYBR green 荧光染料法

      在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同 。

适用
      1、灵敏度高:使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上
      2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉
      3、通用型方法,在国内外科研中普遍使用
      4、高通量大规模的定量PCR检测
      5、专一性要求不高的定量PCR检测

Taqman Probe 荧光探针法

      PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

适用
      1、具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重复性好,特异性更高
      2、适用于扩增序列专一的体系的检测
      3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测
      4、靶基因的特异序列较短,无论怎样优化引物设计条件都不能解决
      5、存在与靶基因同源的序列,在PCR中容易出现非特异性扩增,对特异性要求较高的定量
      6、广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定

委托服务流程

1、签订服务合同:由公司专业的客户服务人员与您就具体的实验情况进行沟通,确定实验方案并签订委托服务协议。
2、设计引物:根据客户提供的目的基因及物种信息,设计、合成特异的引物和探针。并根据客户的具体研究情况选择适宜的内参基因。
3、样品处理: A、客户提供组织、细胞,公司提取RNA并进行RNA的电泳检测
                       B、客户提供RNA,公司直接进行电泳检测
                       C、客户提供cDNA,公司进行内参基因的PCR检测
4、Realtime-PCR实验:A、RNA进行逆转成cDNA
                                        B、利用合成的引物进行普通PCR预实验,选择只有扩增出一条特异条带的引物进行定量PCR
                                        C、构建标准品,建立标准曲线
                                        D、利用ABI公司提供的进口原装试剂盒在ABI7900HT仪器上进行Realtime-PCR 实验
5、出具实验报告:包括样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品的PCR扩增曲线,溶解曲线和标准曲线。

 

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